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基因編輯犬模型

Gene editing dog model

心腦血管疾病模型
心腦血管疾病是一種嚴重威脅人類的疾病,全世界每年死于心腦血管疾病的人數高達1500萬人,居各種死因首位。以ApoE基因編輯犬為代表的廣泛性動脈粥樣硬化模型,在正常飲食的飼喂條件下,出現了顱內動脈粥樣硬化、全身多處血管斑塊和狹窄、腦卒中、下肢壞疽等臨床表型??梢砸源四P蜑榛A進行動脈粥樣硬化和繼發癥的相關研究。
1. ApoE基因編輯犬|全身動脈粥樣硬化模型

背景信息


1

動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是由遺傳、環境等多因素導致的老年多發性疾病。隨著人們生活水平的不斷提高,動脈粥樣硬化的發病率逐年提升,且呈現年輕化的趨勢,其中由冠狀動脈粥樣硬化、顱內動脈硬化引發的冠心病和腦血管疾病成為人類的主要殺手。在眾多的發病因素中,脂質代謝紊亂、尤其是高膽固醇血癥與其關系最為密切。


2

ApoE基因

ApoE基因是血漿脂蛋白的重要組成部分,對脂質在細胞內代謝和分布有重要調節作用,特別是與機體內膽固醇的代謝密切相關。ApoE的低表達或缺失將導致血脂含量的增高,從而誘導動脈粥樣硬化疾病。近年來,ApoE基因敲除小鼠已成為研究AS發病機制及抗AS藥理學研究等方面重要的動物模型之一。雖然小鼠作為AS疾病模型有著廣泛的應用,但由于小鼠與人類親緣關系較遠,壽命短,在體型大小、生理結構、生化指標及脂類代謝途徑上與人類有較大差異,難以準確模擬人類疾病的發生及治療過程,因此在AS的相關研究中尚無準確模擬AS疾病的動物模型。


通過對犬進行全基因組測序分析,共計確定約1.93萬個基因,其中有1.8萬個基因與人類已知基因相同,高于小鼠等其他實驗動物,并且犬在脂類代謝、生理解剖等方面與人類相似,是人類心腦血管疾病研究理想的模式動物。因此,我們針對ApoE基因第3號外顯子進行基因編輯,獲得了4只F0代基因編輯犬:ApoE第3號外顯子雙等位基因突變-34bp/+17bp和-2236bp。



模型犬F0代結果


1

高血脂

4只F0代出生后始終呈現高膽固醇、高低密度脂蛋白的高血脂表型。

出生后30天血脂(已經發表數據)

1.5~2 歲血脂(尚未發表數據)


2

動脈粥樣硬化及并發癥

血管B超:


F0代在接近2周歲時進行血管超聲檢查,結果顯示ApoE基因編輯犬右側頸內動脈起始段后壁探及6.5×1.2mm等回聲扁平斑塊(圖A),流速24/6cm/s(圖B),頸內動脈流速20/6cm/s;左側頸內動脈起始段后壁探及4.1×1.2mm斑塊(圖C),流速21/6cm/s,呈“振蕩型”血流頻譜(圖D),頸內動脈流速11/6cm/s,呈“振蕩型”血流頻譜。腹主動脈后壁探及19.9x1.3mm等回聲扁平斑塊,腎動脈、髂動脈、股淺動脈均可探及不同大小的斑塊,血管不同程度的狹窄。


頸內動脈粥樣硬化(尚未發表圖片)


核磁共振(MRI):


MRI結果顯示ApoE基因編輯犬(Mutant 1)腦梗死。圖A和圖B箭頭所示左額葉、頂葉和顳葉有7.41 ml的大面積梗塞,圖C和圖D中的箭頭表示左基底神經節有1.14 ml的新鮮、急性缺血性梗塞。


腦梗死(尚未發表圖片)


剖檢結果:


1. F0代在均在2周歲左右死于動脈粥樣硬化引發的心、腦血管疾病。剖檢發現:由于冠狀動脈狹窄、心肌纖維缺血缺氧導致心肌纖維化、心腔擴張。


冠狀動脈粥樣硬化(尚未發表圖片)

注:LCA left coronary artery,左冠狀動脈。


2. 兩側頸內動脈、頸外動脈均可見粥樣斑塊,Mutant 1左側頸內動脈斑塊處可見繼發血栓形成(圖A)。


 頸動脈粥樣硬化(尚未發表圖片)

注:LECA left external carotid artery,左側頸外動脈;LICA left internal carotid artery,左側頸內動脈;LCCA left carotis communis artery,左側頸總動脈。RECA right external carotid artery,右側頸外動脈;LICA right internal carotid artery,右側頸內動脈;LCCA right carotis communis artery,右側頸總動脈。


3. 基底動脈、大腦前動脈均可見粥樣斑塊,Mutant 1 基底動脈處可見繼發性血栓形成(圖B),剖檢結果與其生前MRI檢查結果相對應。

顱內動脈粥樣硬化(尚未發表圖片)

注:BA basilar artery,基底動脈;RCA rostral cerebral artery,大腦前動脈


4. 由于模型犬髂動脈、股動脈粥樣硬化、血管狹窄,導致后肢供血不足,足背動脈閉塞,后肢壞疽。


壞疽(尚未發表圖片)


病理結果:


ApoE模型犬左側頸內動脈管腔中存在大量紅細胞(“*”所示)、膽固醇晶體(“→”所示)和斑塊組成的血栓(圖B)?;讋用}內膜層明顯增厚,管腔內膜下有大量泡沫細胞聚集,胞質內含有大量小空泡(“?!彼荆?,管腔幾乎閉塞(圖D)。



ApoE基因編輯犬自出生后始終呈現總膽固醇高、低密度脂蛋白高的高血脂表型,血管B超可見頸內動脈、腹主動脈、腎動脈、髂動脈、股淺動脈等全身多處動脈粥樣硬化斑塊,多數模型犬晚期后肢供血不足、發生壞疽。該模型使用臨床降脂藥物辛伐他汀可有效降低總膽固醇、低密度脂蛋白。剖檢發現模型犬基底動脈、大腦前動脈迂曲鈣化、粥樣硬化,嚴重者甚至出現頸內動脈和基底動脈血栓、腦梗死。ApoE基因編輯犬表型較大程度的模擬了臨床動脈粥樣硬化并發心、腦血管疾病患者的表型,并且對人類使用降脂藥物治療敏感,是較為理想的動脈粥樣硬化相關疾病研究的動物模型。


3

種群數量

F0\F1\F2\F3共120只;


4

模型應用

一、 利用模型犬,進行以下方面致病機制的研究:


1. 動脈粥樣硬化的發病機制機理;

2. 在ApoE模型犬的基礎上,創建多基因編輯(如SR-BI基因、Akt基因、PDGFRβ基因等)動脈粥樣硬化模型犬,深入研究動脈粥樣硬化的發病機制機理;

3. 動脈粥樣硬化并發心血管疾病、腦血管疾病發病機制機理;

4. 微血管病變并發癥如:認知障礙等發病機制機理。


二、 利用模型犬,開展藥物有效性評價與新藥開發實驗:


1. 評估藥物對血脂的影響;

2. 評估藥物對斑塊形成的影響;

3. 評估藥物對動脈粥樣硬化并發心血管疾病、腦血管疾病的治療效果;

4. 評估藥物對動脈粥樣硬化并發認知障礙的治療效果等。


三、 利用模型犬,開展醫療器械、外科手術等非藥物治療有效性實驗與評價;


四、 在模型犬的基礎上,通過飲食誘導、外科手術等方式誘導其他疾病動物模型。




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